日粮铁过量损害肠道屏障完整性并导致肠道菌群失调，加剧了柔嫩艾美耳球虫感染对肉鸡的肠道损伤

一、研究背景
球虫病是危害家禽的常见疾病之一，通过破坏肠道黏膜屏障、扰乱肠道菌群结构，严重影响了鸡只生长性能。养殖生产中，肉鸡球虫病防控依赖化学药物或离子载体类抗球虫药，但长期用药导致耐药性问题也日益严重，疫苗虽在逐步推广，但其效果未达到预期，且存在成本高、强毒株毒副作用、储存困难等问题。鸡肠道球虫感染导致的生产性能下降，已成为制约养禽业发展的关键瓶颈。已有研究证实，清除肠道菌群可显著降低柔嫩艾美耳球虫在肉鸡体内的复制与增殖，提示肠道菌群在球虫感染过程中发挥关键作用。铁是维持动物正常生理活动必需的微量元素，快速生长的肉鸡对铁需求量约为80mg/kg（NRC，1994），但多数商品肉鸡日粮铁含量远超需求，而机体铁循环使得大量日粮铁未被吸收，进而扰乱菌群平衡。已有研究表明，同属顶复门球虫纲的刚地弓形虫，其感染程度与宿主铁含量呈一定正相关。本研究旨在探究铁过量对家禽柔嫩艾美耳球虫感染是否有潜在影响。

二、材料与方法
1、动物与分组选用240只1日龄AA肉鸡，采用2×2因子试验设计，随机分为4组，每组6个重复，每个重复10只。基础日粮按照《中国鸡饲料标准》（NY/T 33-2004）和NRC（1994）配制（铁水平除外）

·对照组（CON）：饲喂添加80mg/kg硫酸亚铁的基础日粮（实测铁含量：143mg/kg），不攻毒

·攻毒组（AG）：饲喂添加80mg/kg硫酸亚铁的基础日粮（实测铁含量：143mg/kg），18日龄时攻毒

·高铁组（HF）：饲喂添加500mg/kg硫酸亚铁的基础日粮（实测铁含量：526mg/kg），不攻毒

·高铁攻毒组（HFA）：饲喂添加500mg/kg硫酸亚铁的基础日粮（实测铁含量：526mg/kg），18日龄时攻毒

2、攻毒处理18 日龄时，AG组与 HFA组每只肉鸡口服接种 8×10⁴个柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊的PBS液，CON组与HF组饲喂等量PBS稀释液。

三、结果与分析
1、体重、存活率、粪便卵囊排放量

柔嫩艾美耳球虫攻毒后显著降低了肉鸡体增重（P<0.05）和存活率（P<0.0001），AG组HFA组之间无显著差异。HFA组在感染后8天时卵囊排出量显著高于其他各组（P<0.001）。这也说明了铁过量会加速球虫的增殖分化。

2、肠道屏障结构与功能

球虫感染与高铁日粮均可造成肠道屏障损伤，二者共存时损伤加剧。HFA 组血清LPS、DAO水平升高，ZO-1、Occludin、Claudin-1表达显著下调。结果表明，铁过量破坏宿主肠道屏障结构与功能，促进球虫对宿主肠道上皮细胞的侵染。

3、肠道炎症与宿主免疫

球虫感染与高铁日粮均上调 IL-1β、IL-8、TNF-α、IFN-γ的mRNA 表达，二者共存时炎症反应进一步加剧。

血清免疫球蛋白检测结果显示，球虫感染后IgA、IgG、IgM水平降低，HFA组血清抗体水平更低。

说明，铁过量加剧了球虫感染后的炎症反应，并抑制适应性免疫。

4、转录调控分析

转录组 WGCNA和GSEA分析显示：HFA组下调基因：三羧酸循环、脂肪酸降解/代谢、碳代谢等能量代谢通路，以及谷胱甘肽代谢、丙酸代谢、过氧化物酶体代谢等体内抗氧化系统相关通路；HFA组上调基因：钙信号通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路等炎症信号相关通路。这间接说明了间接说明铁过量扰乱肠道上皮细胞能量代谢，增加宿主对球虫感染的易感性。

值得注意的是，柔嫩艾美耳球虫侵染宿主细胞与虫体14-3-3接头蛋白密切相关，该蛋白直接受钙依赖性蛋白激酶（CDPKs）调控；肠道上皮细胞钙信号通路激活可放大肠道炎症级联反应，甚至诱导细胞肿瘤转化；钙敏感受体（CaSR）是钙信号通路核心调控因子，也是启动肠道炎症反应、破坏肠道屏障系统的关键介质。结合本研究结果，推测球虫感染后，铁过量可能通过改变盲肠组织钙信号通路，加剧肠道损伤。

5、肠道菌群与结构

本研究发现，球虫感染后宿主盲肠菌群丰富度与均匀度显著降低，整体菌群失调；同时AG、HFA组大肠杆菌、盲肠肠球菌等致病菌丰度升高，有益菌粪杆菌丰度降低。球虫感染后丰度最高的细菌为脆弱拟杆菌。

本研究鉴定出组间差异显著的通路，包括万古霉素耐药（ko01502）、肽聚糖生物合成（ko00550）、半乳糖代谢（ko00052）。

肽聚糖是特定细菌细胞壁基本组分，宿主细胞通过表面模式识别受体 NOD1、NOD2识别肽聚糖，激活NF-κB 等信号通路，进而诱导TNF-α、IL-6等促炎因子表达。本研究中 HFA 组肽聚糖富集程度最低，证实更多肽聚糖被宿主识别或消耗，触发宿主免疫应答。

本研究中，球虫感染组（AG、HFA）微生物半乳糖代谢通路显著下调，大肠杆菌是该通路主要贡献菌，证实球虫感染导致大肠杆菌丰度升高，改变宿主肠道菌群半乳糖代谢，加剧肠道炎症反应。以上结论进一步说明，高铁日粮改变肠道菌群结构与功能，增加致病菌定植、减少有益菌定植。

四、结论
在柔嫩艾美耳球虫感染模型中，铁过量通过提高肠道通透性、放大炎症反应、调控盲肠组织钙信号通路、改变盲肠菌群结构与功能，加剧球虫感染损伤。本研究为养禽业防控柔嫩艾美耳球虫病提出新策略：适当降低日粮中铁的水平。